解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)及其他纖維素降解梭菌能夠通過整合生物加工技術(shù)的策略實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素基生物燃料及化學(xué)品的合成。日前，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所代謝物組學(xué)團(tuán)隊基于前期開發(fā)和優(yōu)化的一系列基因操作工具(Cui GZ, et al, J Microbiol Methods, 2012, 89: 201-8.; Mohr G, Hong W, et al, PloS One 2013, 8:e69032; Cui GZ, Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98: 313-23.)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)了新型梭菌可控基因操作系統(tǒng)，有力推動了梭菌代謝工程研究，促進(jìn)了木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化的工業(yè)化進(jìn)程。相關(guān)成果于3月4日在線發(fā)表在Biotechnology for Biofuels (Zhang J, et al, 2015, 8:36)。
國內(nèi)外研究學(xué)者已經(jīng)針對梭菌開發(fā)出不同的遺傳改造工具，包括用于基因敲除的同源重組及二類內(nèi)含子打靶方法，用于外源基因表達(dá)的基因組整合及質(zhì)粒表達(dá)方法等。單到目前為止仍較缺乏實(shí)現(xiàn)基因可控誘導(dǎo)表達(dá)的高效、嚴(yán)謹(jǐn)工具。
博士生張杰、副研究員劉亞君等構(gòu)建了以阿拉伯糖為特異性誘導(dǎo)劑的高效可控誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)ARAi，該系統(tǒng)包括具有不依賴于氧氣的熒光蛋白報告基因的誘導(dǎo)表達(dá)平臺(圖1A)，基于毒力基因MazF的靈敏的反篩標(biāo)記以及可用于基因精準(zhǔn)打靶的誘導(dǎo)型ClosTron系統(tǒng)。ARAi所具有的阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動子來源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，在有誘導(dǎo)劑存在條件下，其基因表達(dá)水平能上調(diào)800倍以上(圖1B)，這是已知梭菌誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中的最高效率。此外，該研究構(gòu)建的誘導(dǎo)型ClosTron系統(tǒng)的脫靶率從原先的100%下降到0，徹底解決了ClosTron的脫靶問題，實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)的基因敲除。
基于對中溫及嗜熱梭菌遺傳改造技術(shù)研究的成果和經(jīng)驗，劉亞君副研究員于3月3日在Biotechnology Journal在線發(fā)表相關(guān)綜述文章(Liu YJ, et al, 2015. doi:10.1002/biot.201400716)，對基于二類內(nèi)含子的targetron基因打靶技術(shù)及其在代謝工程中的應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)闡述(圖2)，同時展示了該團(tuán)隊近年來在梭菌改造領(lǐng)域的最新進(jìn)展。
上述研究由崔球研究員主持完成，獲得了科技部973、國家自然科學(xué)基金、青島市科技發(fā)展基金等的支持。
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圖1. ARAi系統(tǒng)在解纖維梭菌中的誘導(dǎo)作用。
A, 不依賴于氧氣的綠色熒光蛋白在解纖維梭菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。1,2，無誘導(dǎo)劑；3,4，添加阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑；1,3，細(xì)胞形態(tài)；2,4，熒光檢測。B, 以X-gluc為底物檢測GusA蛋白在解纖維梭菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。1-3，不添加細(xì)胞裂解液或不添加誘導(dǎo)劑的陰性對照；4-6，添加0.1、1或10 g/L阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。C, 以MUG為底物檢測GusA蛋白在解纖維梭菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。在有誘導(dǎo)劑存在條件下，基因表達(dá)水平可上調(diào)超過800倍。
圖2. Targetron結(jié)構(gòu)及其歸巢機(jī)制示意圖。
P，啟動子；T，終止子；RT，反轉(zhuǎn)錄酶；RNP，核糖核蛋白體；E1，E2，DNA靶位點(diǎn)的5’端及3’端外顯子；淺藍(lán)色短線表示intron RNA與DNA靶位點(diǎn)的識別及相互作用；桔色短線表示反轉(zhuǎn)錄酶與靶位點(diǎn)的識別及相互作用。
原文鏈接：
http://www.biotechnologyforbiofuels.com/content/8/1/36
Zhang J, Liu Y-J, Cui G-Z, Cui Q. A novel arabinose-inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum [J]. Biotechnology for biofuels, 2015, 8: 36.
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201400716/full
Liu Y J, Zhang J, Cui G Z, Cui Q. Current progress of targetron technology: Development, improvement and application in metabolic engineering [J]. Biotechnology Journal, 2015, 10.1002/biot.201400716
