為了滿足考察自然界中細胞“原位功能”這一共性科學(xué)需求，“現(xiàn)場”、“實時”的單細胞分選與測序已成為生命科學(xué)裝備研制領(lǐng)域的一個重要發(fā)展趨勢。盡管第三代測序技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)了儀器微型化，但是與測序?qū)拥膯渭毎珳史诌x裝備卻仍然相當(dāng)笨重和昂貴，難以支撐各種科學(xué)考察中針對微生物組功能的“現(xiàn)場分析”。最近，青島能源所單細胞研究中心馬波研究員帶領(lǐng)的微流控系統(tǒng)團隊，通過設(shè)計簡易高效的單細胞分選與測序?qū)友b置，實現(xiàn)了每個試管有且只有一個細胞（“One-Cell-One-Tube”），有望服務(wù)于“現(xiàn)場”、“實時”乃至“便攜式”的單細胞分選與測序。
細胞是地球上生命的功能單元和進化單位，因此單細胞分選與測序技術(shù)能夠在最“深”的精度解析生命的功能機制與進化歷程。在微生物世界中，各種生境下微生物細胞的“原位活性”深刻地塑造著地球生態(tài)系統(tǒng)，但這些活性在樣品轉(zhuǎn)移與運輸過程中往往發(fā)生難以預(yù)測的變化，在實驗室環(huán)境下也通常難以準確保存與嚴格復(fù)制，因此“現(xiàn)場”、“實時”的單細胞分選與測序已成為微生物組方法學(xué)領(lǐng)域的共性挑戰(zhàn)。
與人體和高等動植物細胞相比，微生物細胞通常更小（0.1-10 微米），更加難于精準操縱，因此分離獲取目標單細胞、并且實現(xiàn)測序反應(yīng)要求的“One-Cell-One-Tube”是一個關(guān)鍵難點。目前的自動單細胞分離方法大多依賴于昂貴且體積龐大的熒光流式細胞分選儀（FACS）；而現(xiàn)有的手動單細胞分離和測序方案，在依賴于操作人員熟練程度的同時，同樣需要顯微單細胞移液平臺、激光光鑷等同樣難以隨身攜帶的大中型儀器。此外，單細胞分選及核酸制備過程極易受到環(huán)境中飄浮微生物及其DNA的污染，而且這種污染通常難以在測序數(shù)據(jù)處理環(huán)節(jié)完全去除。因此，盡管目前MinION等第三代測序儀已經(jīng)實現(xiàn)了便攜化，微生物單細胞分選和測序仍然操作繁瑣、污染干擾嚴重、而且難以滿足“現(xiàn)場”、“實時”乃至“便攜式”的要求。
針對上述挑戰(zhàn)，單細胞中心張強和王婷婷等發(fā)明了一種名為“FOCOT（Facile One-Cell-One-Tube）”的方法，能夠精確、高速、低成本地分離、獲取與分裝單個微生物細胞，從而與單細胞測序直接對接。首先，通過微流控技術(shù)，將細胞分散包裹在數(shù)十微米直徑的油包水微液滴中。其次，基于液滴顯微光學(xué)成像識別技術(shù)，分選出單細胞包裹液滴。第三，將單細胞包裹液滴順序分布于系列試管中，從而快速實現(xiàn)單個細胞的分離，以及每個試管有且只有一個細胞，以實現(xiàn)與單細胞全基因組擴增與測序的直接對接。
FOCOT平臺主要有三個特色。第一，在簡易方便方面，FOCOT平臺除自行設(shè)計的芯片之外，僅需要電磁閥、平板電腦和普通光學(xué)顯微鏡，不需外接任何高成本商品化儀器平臺，具有易獲取、易替換、低成本等優(yōu)勢。同時，模塊化、小型化、操作簡便的設(shè)計使得該裝置適合在自然環(huán)境實地采樣條件下的攜帶、裝配和使用，也幾乎不需要額外的人員培訓(xùn)和技術(shù)維護，因此尤其適用于面向各種極端自然環(huán)境的科學(xué)考察，也有利于在普通實驗室的推廣應(yīng)用。
第二，在分選高效方面，FOCOT平臺通過顯微鏡下對包裹有單個細胞的液滴的準確識別和分選，能有效避免假陽性；而且其20秒每個的分選速度，與顯微單細胞移液、激光光鑷等現(xiàn)有的商品化分選裝備相比具有明顯優(yōu)勢。同時，單細胞獲取率高于90%，培養(yǎng)成功比例至少80%，證明該方法能有效避免芯片表面吸附所導(dǎo)致的輸運過程中細胞流失，而且對細胞活性沒有或較小損傷。
第三，在污染控制方面，FOCOT平臺涉及部件少，體積小型化，相對封閉，故在實驗過程中，能夠方便地實現(xiàn)超潔凈環(huán)境空間控制、芯片消毒等操作，嚴格控制環(huán)境DNA的污染。對分離獲取的單個酵母細胞進行全基因組擴增與測序后結(jié)果顯示，99%的有效序列可以與參考基因組匹配，表明該方法能有效避免環(huán)境中微生物帶來的DNA污染，平均基因組覆蓋率達到43.3%，與在昂貴的超凈空間設(shè)施中采用FACS等大型儀器系統(tǒng)分離獲取單細胞所獲得的測序結(jié)果相當(dāng)。
目前，通過耦合FOCOT與中心前期開發(fā)的單細胞拉曼成像、拉曼流式細胞分選等技術(shù)，單細胞中心正在構(gòu)建一個服務(wù)于岸基、船基乃至手基等不同需求的非標記式單細胞分析裝備體系，以服務(wù)于能源、環(huán)境、健康、海洋、土壤等諸多微生物組應(yīng)用領(lǐng)域。
上述工作由單細胞中心馬波和徐健共同主持完成，獲得了國家基金委科學(xué)儀器基礎(chǔ)研究專項、面上項目和中科院生物高通量分析技術(shù)服務(wù)網(wǎng)絡(luò)（STS）等項目的支持。
附錄：
Qiang Zhang, Tingting Wang, Qian Zhou, Peng Zhang, Yanhai Gong, Honglei Gou, Jian Xu, and Bo Ma, Development of a facile droplet-based single-cell isolation platform for cultivation and genomic analysis in microorganisms. Sci Rep, 7:41192, DOI: 10.1038/srep41192
