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科技進(jìn)展
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青島能源所在藍(lán)細(xì)菌光合生物合成乙醇（CTE）方面取得系列進(jìn)展

發(fā)布時間: 2017-04-19
撰稿: 青島生物能源與過程研究所
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　　 乙醇是生產(chǎn)規(guī)模最大、應(yīng)用程度最高的可再生生物液體燃料。現(xiàn)階段，生物乙醇的主要來源是采用含糖量豐富的農(nóng)業(yè)生物質(zhì)為原料的生物煉制過程，以“玉米乙醇”最具代表性，然而其“與糧爭地、與人爭糧”的原料供應(yīng)模式引發(fā)了極大的社會爭議；以木質(zhì)纖維素等農(nóng)業(yè)、林業(yè)廢棄物為原料的纖維素乙醇合成技術(shù)緩解了“糧食乙醇”在原料供應(yīng)上的不足，但是纖維素原料的預(yù)處理及酶解糖化過程需要消耗大量能量、水和纖維素酶，從而極大地拉高了生產(chǎn)成本。與生物煉制過程相比，通過光合微生物平臺將二氧化碳和太陽能直接轉(zhuǎn)化為乙醇的技術(shù)路線（CO2 To Ethanol, CTE）減少了原材料預(yù)處理、底物提煉過程的損耗，也節(jié)省了對淡水和用地的需求，在經(jīng)濟性與可持續(xù)性上表現(xiàn)出更大的潛力與優(yōu)勢。

　　 青島能源所微生物代謝工程團隊在藍(lán)細(xì)菌光合生物合成乙醇技術(shù)方面取得了系列研究進(jìn)展。該團隊以重要的模式藍(lán)細(xì)菌集胞藻PCC6803（Synechocystis sp. PCC6803）為底盤藻株，將來自運動發(fā)酵單胞菌的PdcZM-AdhIIZM（丙酮酸脫羧酶-II型醇脫氫酶）途徑導(dǎo)入PCC6803，打通了乙醇光合合成路線，實現(xiàn)了工程藻株中乙醇的合成與分泌；針對藍(lán)細(xì)菌生理和代謝背景特性分析，使用來自集胞藻PCC6803自身的NADPH依賴型的II型醇脫氫酶基因slr1192替換AdhIIZM后，成功的優(yōu)化了乙醇合成途徑與底盤藻株的適配性，使乙醇產(chǎn)量提高了50%；在此基礎(chǔ)上結(jié)合競爭性途徑敲除和代謝途徑拷貝數(shù)強化等策略，最終獲得了具有較強乙醇光合合成能力的工程藻株Syn-HZ24，在柱式反應(yīng)器中經(jīng)過28天培養(yǎng)后，乙醇產(chǎn)量達(dá)到5.5g/L，合成速率0.2g/L/day，處于國際領(lǐng)先水平。上述結(jié)果奠定了該團隊在藍(lán)細(xì)菌乙醇方向上的研究基礎(chǔ)，已經(jīng)發(fā)表于能源類頂級期刊Energy & Environmental Science（Gao, et al, 2012, 5:9857–9865）。

　　 為了進(jìn)一步提升藍(lán)細(xì)菌工程藻株乙醇光合合成的潛力，該團隊采用體外重構(gòu)和動態(tài)分析的策略對新發(fā)展的PdcZM-slr1192途徑的催化特性進(jìn)行了深入挖掘。首先脫離復(fù)雜的胞內(nèi)環(huán)境在胞外重新構(gòu)建該途徑，以純化后的酶（PdcZM/slr1192）、底物（丙酮酸，Pyruvate）、輔因子（NADPH/NADH/TPP）、金屬離子（Mg2+）以及中間產(chǎn)物（乙醛，acetaldehyde）對整個途徑的催化效率影響分別進(jìn)行定量的滴定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響乙醇合成的限制因素是PdcZM而非slr1192；在總蛋白濃度設(shè)置恒定的條件下，PdcZM-slr1192的濃度比為4:6時，全途徑具有最大的乙醇合成催化活性。為了驗證Cell free條件下獲得的結(jié)果，研究人員在集胞藻PCC6803中構(gòu)建了PdcZM-slr1192濃度配比不同的工程菌株，通過代謝工程結(jié)合酶活與蛋白含量分析實驗，證實了現(xiàn)有工程藻株中PdcZM的表達(dá)量和活性是乙醇合成能力的首要限制因素。此外，體外重構(gòu)體系中的滴定數(shù)據(jù)結(jié)合藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)代謝物的實際含量分析還顯示，提高NADPH和丙酮酸的供應(yīng)量也應(yīng)該是提高乙醇合成效率的重要選擇。上述結(jié)果明確了藍(lán)細(xì)菌乙醇光合工程藻株進(jìn)一步改造的方向，已經(jīng)發(fā)表在生物能源領(lǐng)域重要期刊Biotechnology for Biofuels（Luan, et al, 2015, 8:184）。

圖1. 采用BICCS補碳策略提高培養(yǎng)體系pH值以抑制雜菌污染并恢復(fù)乙醇合成

　　基于已經(jīng)開發(fā)的藍(lán)細(xì)菌乙醇光合工程藻株，該團隊又進(jìn)一步探索了光合細(xì)胞工廠的擴大化培養(yǎng)技術(shù)。光合生物制造通常在戶外、開放式、未滅菌的條件下進(jìn)行，因此經(jīng)常面臨各種模式的生物污染的嚴(yán)重威脅進(jìn)而導(dǎo)致擴大培養(yǎng)的失敗。研究人員在進(jìn)行工程藻株Syn-HZ24的開放式、規(guī)?；囵B(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，其乙醇合成與積累過程受到了微生物污染的嚴(yán)重影響。通過分析和鑒定，確定了Pannonibacter phragmitetus為乙醇光合合成的主要威脅來源，該菌可以以乙醇為唯一碳源進(jìn)行生長，迅速消耗工程藻株合成的乙醇并在培養(yǎng)體系中大量增殖。通過對Pannonibacter phragmitetus和Syn-HZ24的生理和生化分析，研究人員提出提高培養(yǎng)體系pH值來抑制Pannonibacter phragmitetus侵染并恢復(fù)乙醇光合合成的設(shè)想（Bicarbonate-based Integrated Carbon Capture System, BICCS），并在實驗室柱式反應(yīng)器和戶外薄膜掛袋兩種體系下進(jìn)行了驗證，結(jié)果表明該策略可以有效解決Syn-HZ24在開放式培養(yǎng)過程中的生物污染問題，在規(guī)?；囵B(yǎng)9天后乙醇產(chǎn)量達(dá)到0.9g/L，而常規(guī)pH條件下的對照體系中無乙醇積累。此部分工作鑒定了一種工程藍(lán)細(xì)菌規(guī)模化培養(yǎng)過程中新的生物污染模式，并針對性的設(shè)計、驗證了解決方案，對光合細(xì)胞工廠培養(yǎng)的工程化、規(guī)?；l(fā)展有普遍的借鑒意義。該工作近期發(fā)表于Biotechnology for Biofuels雜志上（Zhu, et al, 2017, 10:93）。

圖2. 藍(lán)細(xì)菌乙醇光合工程藻株的實驗室培養(yǎng)和戶外規(guī)?；囵B(yǎng)

　　上述研究獲得國家自然科學(xué)基金、863計劃、山東省泰山學(xué)者項目、山東省自然科學(xué)基金以及青島市創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項目的支持。

　　原文鏈接：

http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2012/ee/c2ee22675h#!divAbstract

Gao Z#, Zhao H#, Li Z, Tan X, Lu X*. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy & Environmental Science, 2012, 5:9857-9865.

https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-015-0367-z

Luan G#, Qi Y#, Wang M, Li Z, Duan Y, Tan X, Lu X*. Combinatory strategy for characterizing and understanding the ethanol synthesis pathway in cyanobacteria cell factories. Biotechnology for Biofuels, 2015, 8:184.

https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0765-5

Zhu Z, Luan G*, Tan X, Zhang H, Lu X*. Rescuing ethanol photosynthetic production of cyanobacteria in non-sterilized outdoor cultivations with a bicarbonate-based pH-rising strategy. Biotechnology for Biofuels, 2017, 10:93.

　　

　　 

　　 

　　

　　
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