辛伐他汀（Zocor）是土曲霉天然產(chǎn)物洛伐他汀的半合成衍生物，是一種重要的降血脂藥，2015年全球銷售額達(dá)到30億美元。辛伐他汀的工業(yè)生產(chǎn)工藝可分為三個過程：土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀，堿水解洛伐他汀制備monacolin J，化學(xué)方法將monacolin J轉(zhuǎn)化成辛伐他汀（圖1）。針對monacolin J轉(zhuǎn)化成辛伐他汀，美國研究人員前期開發(fā)了基于?；D(zhuǎn)移酶LovD的生物催化轉(zhuǎn)化方法，并獲得2012年美國總統(tǒng)綠色化學(xué)獎。但monacolin J的制備仍然是使用傳統(tǒng)的堿水解洛伐他汀工藝，工序相對復(fù)雜、環(huán)境污染較大。因此，開發(fā)一種綠色高效的monacolin J生產(chǎn)方法非常重要。包括默克公司在內(nèi)的研究團(tuán)隊曾試圖開發(fā)可替代的生物轉(zhuǎn)化方法，但是由于效率較低，都未能應(yīng)用到實際生產(chǎn)中。近年來，青島能源所微生物代謝工程團(tuán)隊（mme.qibebt.ac.cn）基于在絲狀真菌遺傳改造方面的研究基礎(chǔ)，與全球最大的洛伐他汀/辛伐他汀原料藥生產(chǎn)企業(yè)浙江海正藥業(yè)集團(tuán)進(jìn)行了深入合作，旨在對海正藥業(yè)的洛伐他汀工業(yè)生產(chǎn)土曲霉菌株進(jìn)行代謝工程改造，使之能直接發(fā)酵生產(chǎn)monacolin J。
圖1. 辛伐他汀生產(chǎn)工藝及本項目研究方案示意圖
為了遺傳改造工作的順利進(jìn)行，該團(tuán)隊開發(fā)了一個高效的土曲霉遺傳操作平臺，克隆表征了一系列高效土曲霉啟動子，為遺傳改造提供啟動子元件支持；通過失活非同源重組末端連接途徑使基因打靶效率從5%提高到90%以上，解決了基因打靶低下的問題；又結(jié)合尿嘧啶營養(yǎng)缺陷雙向篩選體系和改良的Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)實現(xiàn)了篩選標(biāo)簽的循環(huán)利用，突破了篩選標(biāo)簽不足的限制。該平臺為后續(xù)的基因工程改造提供了技術(shù)平臺支持（Huang X., et al., 2014，Huang X., et al., 2016）。
近期，研究團(tuán)隊通過體外實驗鑒定了一個能高效水解洛伐他汀生成monacolin J的洛伐他汀水解酶PcEST，其活性遠(yuǎn)高于專利報道的洛伐他汀水解酶，是后者的232倍，而氨基酸序列一致性僅為16.8%，這說明PcEST是不受現(xiàn)有知識產(chǎn)權(quán)限制的高效洛伐他汀水解酶，為研究成果的實際應(yīng)用提供了知識產(chǎn)權(quán)保障。
基于洛伐他汀水解酶PcEST，該團(tuán)隊對海正藥業(yè)的洛伐他汀工業(yè)生產(chǎn)土曲霉菌株進(jìn)行了遺傳改造。利用強(qiáng)啟動子PgpdAT異源表達(dá)洛伐他汀水解酶，成功地在不影響他汀化合物總產(chǎn)量的情況下將體內(nèi)合成的洛伐他汀水解成了monacolin J，水解率達(dá)到95%，從而獲得了能直接發(fā)酵生產(chǎn)monacolin J的土曲霉細(xì)胞工廠。實現(xiàn)了直接利用現(xiàn)有的洛伐他汀發(fā)酵工藝和設(shè)備，一步發(fā)酵直接生產(chǎn)monacolin J ，不再需要洛伐他汀水解過程，簡化了辛伐他汀的生產(chǎn)工藝，有望降低企業(yè)的生產(chǎn)成本和污染排放。該工作近日發(fā)表于Metabolic Engineering雜志上（Huang X., et al, 2017），并與海正藥業(yè)聯(lián)合申請了發(fā)明專利（201611079430.2）。
上述研究獲得國家自然科學(xué)基金和海正藥業(yè)集團(tuán)的支持。（文/圖 黃雪年）
圖2. 產(chǎn)monacolin J土曲霉細(xì)胞工廠構(gòu)建
1）Huang X., Liang Y., Yang Y., Lu X.*, Single-step production of the simvastatin precursor monacolin J by engineering of an industrial strain of Aspergillus terreus, Metabolic Engineering, 2017, 42: 109–114.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717617301180
2）Huang X., Chen M., Li J., Lu X.*, Establishing an efficient gene-targeting system in an itaconic acid producing Aspergillus terreus strain, Biotechnology letters, 2016, 38(9):1603-1610.
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10529-016-2143-y
3）Huang X., Lu X., Li J., Cloning, characterization and application of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter from Aspergillus terreus. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2014, 41(3): 585- 592.
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10295-013-1385-0
4) 呂雪峰，黃雪年，楊勇，鄭玲輝，黃雋，滕云，應(yīng)玲萍，“2-甲基丁酸側(cè)鏈水解酶和產(chǎn)莫納克林J的曲霉菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用”，發(fā)明專利，申請?zhí)枺?/span>201611079430.2；
5) 呂雪峰，黃雪年，李建軍，陳梅，“一種切除篩選標(biāo)簽的方法與應(yīng)用”，發(fā)明專利，申請?zhí)枺?/span>2015102756323；
6) 呂雪峰，黃雪年，李建軍，陳梅，“一種提高基因打靶技術(shù)在土曲霉中應(yīng)用效率的方法與應(yīng)用”，發(fā)明專利，申請?zhí)枺?/span>2015102754915；
7）呂雪峰，黃雪年，李建軍，陳梅，“一種具有高效同源重組能力的土曲霉及其構(gòu)建方法與應(yīng)用”，發(fā)明專利，申請?zhí)枺?/span>2015102752731；
