抗生素的濫用導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性蔓延這一“世紀(jì)危機”。為了推動全社會合理使用抗生素，世界衛(wèi)生組織（WHO）自2015年以來將每年11月的第三周確定為“世界提高抗生素認(rèn)識周（World Antibiotic Awareness Week, WAAW）”。在2018年WAAW來臨之際，青島能源所發(fā)布了自主研發(fā)的國內(nèi)外首臺套“臨床單細(xì)胞拉曼耐藥性快檢儀”（Clinical Antimicrobial Resistance Ramanometry; CAMR-R）。該系統(tǒng)通過重水標(biāo)記單細(xì)胞拉曼光譜，不需細(xì)胞擴增而直接測量臨床病菌單細(xì)胞精度的耐藥表型，全流程可在三小時內(nèi)完成。因此，CAMR-R為臨床合理使用抗生素提供了原創(chuàng)的解決方案。
抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性蔓延、“超級病菌”頻發(fā)，以至于臨床感染在不遠的將來將“無藥可用”。因此，臨床上抗生素的合理使用是遏制耐藥性傳播的前提與關(guān)鍵，而前者則取決于臨床耐藥性快檢技術(shù)的突破。
長期以來, 臨床上病原菌耐藥性檢測均基于“培養(yǎng)法”，其基本原理是，通過測量藥物對病原菌細(xì)胞的生長抑制程度，來評價其耐藥性。由于無法擺脫病菌的培養(yǎng)與純化過程，這些方法通常耗時長達24~48 小時，難以滿足臨床快檢現(xiàn)實需求，對于尚難培養(yǎng)或生長緩慢的病菌更是無能為力。核酸檢測及全基因組測序等分子診斷技術(shù)，只適用于已知耐藥基因的檢測，對于未知基因或機制造成的耐藥性則束手無策。而且它們僅能 “推斷”耐藥可能性，卻無法“定量”檢測耐藥性。而臨床上須基于“耐藥表型”進行“耐藥性確診”，以可靠地指導(dǎo)用藥。
在臨床需求與技術(shù)現(xiàn)狀矛盾日益突出的情勢下，開發(fā)基于原理創(chuàng)新的耐藥性快檢方法學(xué)已成為國際共性挑戰(zhàn)。例如，美國NIH 正懸賞二千萬美元激勵細(xì)菌耐藥性快檢技術(shù)開發(fā)，力求在2022 年底前開發(fā)出臨床耐藥性快檢技術(shù)。
青島能源所單細(xì)胞中心前期發(fā)表了一系列論文，提出了“重水標(biāo)記單細(xì)胞拉曼耐藥性快檢”與“單細(xì)胞拉曼藥物應(yīng)激條形碼”的原理，引入了“最小代謝活性抑制濃度”（MIC-MA）的概念，發(fā)明了“單細(xì)胞光鑷微液滴拉曼分選”（RAGE）、“單細(xì)胞流式拉曼分選”（RAMS）和“單細(xì)胞微液滴流式拉曼分選”（RADS）等技術(shù)及其核心器件?；谶@些方法學(xué)革新，單細(xì)胞中心研制成功首臺套“臨床單細(xì)胞拉曼耐藥性快檢儀”原理樣機。
CAMR-R乃基于單細(xì)胞中心前期發(fā)明的重水拉曼組耐藥性快檢原理（D2O-Ramanometry）。當(dāng)代謝活躍的細(xì)胞利用氘標(biāo)記的水分子（重水）時，氘原子會參與細(xì)胞脂質(zhì)合成過程，形成C-D 鍵并替換原有的C-H 鍵，且氘峰替換率（C-D Ratio）與細(xì)胞代謝活性線性相關(guān)。這一過程可通過單細(xì)胞拉曼光譜定量檢測。因此，通過比較抗生素處理下的單細(xì)胞拉曼光譜之C-D Ratio 變化，可以在單個細(xì)胞精度檢測抗生素作用下的代謝活性強弱，從而實現(xiàn)免培養(yǎng)的耐藥性快檢。由于所有的病原細(xì)胞維持生命活動都需要“喝水”，因此CAMR-R對于各種臨床病原菌具有廣譜的適用性。
迄今為止，MIC指數(shù)，即體外培養(yǎng)細(xì)菌24小時后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌生長的最低藥物濃度，一直是微生物藥敏試驗、抗菌藥效評價和臨床抗菌方案制定的主流標(biāo)準(zhǔn)與主要依據(jù)之一。然而其測量不僅耗時耗力，且對難以實驗室培養(yǎng)或生長緩慢的病菌無能為力。尤其關(guān)鍵的是，MIC只能從抑制細(xì)胞數(shù)目擴增這一角度反映與測量藥效，卻無法檢測處于“NGMA”（Non-Growing but Metabolically Active）狀態(tài)的病菌，即在藥物作用下已經(jīng)不再增殖但仍然具備代謝活性的存活細(xì)胞。這種狀態(tài)的病菌在臨床上十分常見，如果在抗菌治療中成為漏網(wǎng)之魚，將貽誤病情，引起復(fù)發(fā)性感染，進而誘導(dǎo)耐藥菌乃至“超級細(xì)菌”的頻繁出現(xiàn)。因此根據(jù)MIC制定抗菌治療方案有可能出現(xiàn)“不夠快、不夠準(zhǔn)、不夠狠”的情況。
為了克服MIC的核心缺陷， CAMR-R測量的是單細(xì)胞中心前期發(fā)表的 “基于代謝活性的最低抑菌濃度”（“MIC-MA”指數(shù)）這一全新的抗菌藥效指標(biāo)，即藥物作用后所有病菌細(xì)胞的代謝活性徹底被抑制的最低藥物劑量。由于無需細(xì)胞培養(yǎng)、而且能夠檢測“NGMA”狀態(tài)的病菌細(xì)胞，MIC-MA在實現(xiàn)“快、準(zhǔn)、狠”的臨床抗生素用藥方面，與MIC相比，具有重要的特色與優(yōu)勢。
CAMR-R搭載了自主研發(fā)的“臨床單細(xì)胞拉曼耐藥性分析”智能信息系統(tǒng)。耐藥性拉曼組自動采集軟件（CAMR-RamLIS）可快速、準(zhǔn)確、智能化地獲取單細(xì)胞拉曼光譜信息。耐藥性拉曼組分析軟件（CAMR-RamEX）基于重水標(biāo)記單細(xì)胞拉曼光譜，計算臨床樣品中病原細(xì)胞的耐藥性及其異質(zhì)性。與此同時，耐藥性拉曼組數(shù)據(jù)庫（CAMR-RamDB）通過多層次/易擴展的臨床病原微生物單細(xì)胞拉曼數(shù)據(jù)庫及拉曼組搜索引擎，支撐自動化、高通量的病原微生物種類識別。在此基礎(chǔ)上，通過耦合獨創(chuàng)的RAGE分選模塊，快速分選出特定耐藥性表型的細(xì)胞，并對接下游的單細(xì)胞基因組測序，從而深入考察耐藥性的起源與傳播機制。
此外，CAMR-R還攜帶了三個主要試劑盒：單細(xì)胞拉曼耐藥性快檢試劑盒服務(wù)于臨床樣品重水飼喂和重水標(biāo)記單細(xì)胞拉曼光譜的測量；拉曼光鑷液滴單細(xì)胞分選試劑盒包括RAGE芯片及其附件，用于特定耐藥性細(xì)胞的快速分選；單細(xì)胞全基因組擴增試劑盒則服務(wù)于分選后單細(xì)胞的裂解與核酸擴增，從而與單細(xì)胞測序?qū)印?/p>
CAMR-R在檢測原理、核心器件、分析軟件和儀器系統(tǒng)等環(huán)節(jié)均具有自主知識產(chǎn)權(quán)。目前，在國家重大科學(xué)儀器研制項目的支持下，單細(xì)胞中心正開發(fā)高通量、自動化的CAMR-R系統(tǒng)，并與國內(nèi)外的醫(yī)療機構(gòu)和工業(yè)界合作，設(shè)計與示范針對腸球菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯氏菌、不動桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、結(jié)核分枝桿菌等臨床主要威脅病原的耐藥快檢流程與醫(yī)學(xué)檢驗設(shè)施，服務(wù)于國內(nèi)外首個“臨床單細(xì)胞耐藥性監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)”與“臨床單細(xì)胞耐藥性大數(shù)據(jù)系統(tǒng)”的建設(shè)。 （文/徐健 圖/朱鵬飛）
圖一、CAMR-R的工作原理示意圖（動畫）
參考文獻：
Yifan Tao, Yun Wang, Shi Huang, Pengfei Zhu, Wei E. Huang, Junqi Ling, Jian Xu. Metabolic activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell Raman microspectroscopy. Anal Chem, 2017, 89(7): 4108-15.
Xixian Wang, Lihui Ren, Yetian Su, Yuetong Ji, Yaoping Liu, Chunyu Li, Xunrong Li, Yi Zhang,Wei Wang, Qiang Hu, Danxiang Han, Jian Xu, Bo Ma. Raman-activated droplet sorting (RADS) for label-free high-throughput screening of microalgal single-cells. Anal Chem, 2017, 89(22):12569-77.
Lin Teng, Xian Wang, Xiaojun Wang, Honglei Gou, Lihui Ren, Tingting Wang, Yun Wang, Yuetong Ji, Wei E. Huang, Jian Xu. Label-free, rapid and quantitative phenotyping of stress response in E. coli via Ramanome. Sci Rep, 2016, 6：34359.
