小分子烷烴碳-氫鍵的選擇性羥化是科學(xué)界長期以來一直面臨的重要挑戰(zhàn)之一，其主要瓶頸在于烷烴分子碳-氫鍵的鍵解離能比相應(yīng)醇產(chǎn)物更高，導(dǎo)致傳統(tǒng)的化學(xué)氧化容易產(chǎn)生過度氧化產(chǎn)物如醛和酸，甚至二氧化碳等。雖然自然界中存在可以直接選擇氧化小分子烷烴的天然酶，比如甲烷單加氧酶MMO、丁烷單加氧酶BMO、以及真菌過加氧酶AaeUPO等，但無論其催化效率還是種類數(shù)量都還不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。開發(fā)小分子烷烴碳-氫鍵選擇性羥化的工程酶是當(dāng)前國際前沿研究領(lǐng)域之一，對于實現(xiàn)天然氣的“氣液轉(zhuǎn)化”利用、滿足日益增長的能源與化工原料來源需求和環(huán)境保護(hù)都有重要意義。
細(xì)胞色素P450酶是公認(rèn)的多功能生物氧化催化劑，其催化惰性碳-氫鍵選擇性氧化的能力尤其受到關(guān)注，被認(rèn)為具有改造為小分子烷烴羥化酶的極大潛力。過去十多年來，以2018年諾貝爾獎得主Arnold教授、以及牛津大學(xué)Wong教授、名古屋大學(xué)Watanabe教授、馬普煤炭研究所Reetz教授等為代表的一批國際知名研究小組已在這一領(lǐng)域取得重要進(jìn)展，他們利用蛋白質(zhì)工程和底物誤識別策略等手段獲得了一系列對丙烷和乙烷等小分子烷烴具有高選擇性和高活性的P450工程酶。然而，P450酶催化功能的實現(xiàn)高度依賴還原輔酶NAD(P)H及其復(fù)雜的還原伴侶電子傳遞體系來活化分子氧，這在一定程度上限制了其體外催化應(yīng)用。最近，青島能源所叢志奇研究員帶領(lǐng)的單碳酶催化研究組開發(fā)出雙功能小分子（DFSM）促進(jìn)的細(xì)胞色素P450（BM3）過加氧酶催化體系，使其能夠直接利用H2O2實現(xiàn)對非天然底物如苯乙烯和苯甲硫醚等的高效氧化，從而解除了NAD(P)H和電子傳遞體系對P450酶的限制（Angew. Chem., Int. Ed. 2018, 57, 7628-7633. Selected as Very Important Paper and Frontispiece, Highlighted by ChemistryViews, 相關(guān)鏈接：雙功能小分子的魔術(shù)：青島能源所開發(fā)理性設(shè)計P450過加氧酶的新策略）。近日，研究人員將上述策略與酶的半理性設(shè)計有機結(jié)合，通過對活性口袋關(guān)鍵位點的疊加突變研究，首次成功獲得了對丙烷及其他低碳烷烴（C3-C6）具有高羥化活性和選擇性的工程P450過加氧酶（圖1），其反應(yīng)總轉(zhuǎn)化數(shù)可以和已知唯一可利用過氧化氫氧化小分子烷烴的天然過加氧酶AaeUPO相媲美，產(chǎn)物生成速率與已報道的NADPH依賴P450工程酶高效體系相當(dāng)。這項研究為開發(fā)烷烴小分子碳-氫鍵選擇性羥化的工程酶提供了新的途徑和思路。另外，該人工過加氧酶體系還呈現(xiàn)出了與已報道的NADPH依賴P450酶不同的性質(zhì)，比如對中等鏈長烷烴的區(qū)域選擇性差異、對天然酶實現(xiàn)催化功能不可或缺高度保守位點的突變反而有助于催化活性的改善，這些結(jié)果顯示該人工P450過加氧酶體系在生物催化領(lǐng)域有著更廣闊的潛在應(yīng)用。
目前相關(guān)工作已發(fā)表在國際催化領(lǐng)域權(quán)威雜志ACS Catalysis（影響因子：12.221）上（ACS Catal. 2019, 9, 7350-7355）。博士研究生陳杰為論文第一作者，叢志奇研究員為通訊作者。該研究得到國家自然科學(xué)基金、青島市創(chuàng)新領(lǐng)軍人才計劃、青島能源所“一三五”重點培育方向、中科院生物燃料重點實驗室主任創(chuàng)新基金等項目的大力支持。（文/圖 陳杰 叢志奇）
圖1人工P450BM3過加氧酶系統(tǒng)催化小分子烷烴選擇性羥化
附錄：
Chen, J.; Kong, F.; Ma, N.; Zhao, P.; Liu, C.; Wang, X.; Cong, Z.*, Peroxide-Driven Hydroxylation of Small Alkanes Catalyzed by an Artificial P450BM3 Peroxygenase System. ACS Catal. 2019, 7350-7355.
