DNA的從頭合成是合成生物技術(shù)的基礎(chǔ)平臺(tái)之一。但是，由于大規(guī)模DNA合成過程中難以避免地產(chǎn)生錯(cuò)誤，DNA糾錯(cuò)環(huán)節(jié)的效率和經(jīng)濟(jì)性已經(jīng)成為限制DNA合成質(zhì)量、通量與成本的關(guān)鍵問題之一。針對(duì)此瓶頸，青島能源所單細(xì)胞中心研發(fā)出高耐久低成本的DNA合成糾錯(cuò)系統(tǒng)，大幅度提高了DNA糾錯(cuò)環(huán)節(jié)的效率和經(jīng)濟(jì)性。該工作發(fā)表于ACS Synthetic Biology。
就像我們寫字一樣，DNA合成是一個(gè)容易出錯(cuò)的過程。寡核苷酸的化學(xué)合成、DNA聚合酶的延伸、基于寡核苷酸的基因片段組裝等大片段DNA合成的每一步驟均可能引入錯(cuò)誤堿基。這些“錯(cuò)誤”如果沒有及時(shí)“糾正”，它們將隨著核酸鏈的復(fù)制而傳播和擴(kuò)散，導(dǎo)致DNA合成產(chǎn)物中一般只有5%-60%具有完全正確的序列。因此，DNA糾錯(cuò)環(huán)節(jié)的效率和經(jīng)濟(jì)性已經(jīng)成為限制DNA合成質(zhì)量、通量與成本的關(guān)鍵問題之一。
與其它的酶糾錯(cuò)系統(tǒng)相比，DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白（MutS）的糾錯(cuò)效率較高，而且使用相對(duì)簡便。但在實(shí)際應(yīng)用中，MutS酶活的持久性較差，在7天左右即開始顯著下降，導(dǎo)致在一個(gè)完整的基因組合成流程中需要多次表達(dá)與純化。這不僅阻礙了糾錯(cuò)環(huán)節(jié)的通量化和規(guī)?；?，也限制了MutS糾錯(cuò)系統(tǒng)的工業(yè)化應(yīng)用。
針對(duì)這一瓶頸問題，單細(xì)胞中心張佳博士帶領(lǐng)的攻關(guān)小組，首先，提出了基于搭建人工二硫鍵來提高酶活持久性的思路，根據(jù)MutS的X射線晶體結(jié)構(gòu)，理性設(shè)計(jì)了10組可能顯著提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的二硫鍵，并從實(shí)驗(yàn)中篩選出最佳的組合。其次，通過與麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP)的融合表達(dá)，來提高M(jìn)utS蛋白的異源表達(dá)量。最后，通過儲(chǔ)存條件的優(yōu)化，將MutS蛋白與纖維素結(jié)合掛柱并保存在四攝氏度，進(jìn)一步提高了MutS的使用壽命。最終構(gòu)建的名為iMICC的DNA合成糾錯(cuò)系統(tǒng)，在保證糾錯(cuò)性能的前提下，能夠保持峰值酶活長達(dá)63天，因此不再需要頻繁地重復(fù)制備新鮮的MutS。同時(shí)，成品掛柱的儲(chǔ)存方式還大大提高了使用的便捷性。
針對(duì)在溶液中合成Cas9同源基因和在芯片上合成木糖還原酶同源基因等的驗(yàn)證表明，iMICC能夠?qū)⒒蚝铣僧a(chǎn)物的錯(cuò)誤率分別降低到0.64 / Kb和0.41 / Kb，組裝成的正確片段占比72.1％和86.4％，而成本僅為$0.37/反應(yīng)。因此，iMICC能夠?qū)⒒蚝铣蛇^程中的堿基準(zhǔn)確性提高37.6倍，同時(shí)大幅度提高了使用壽命。與常用的商品化糾錯(cuò)酶CorrectASE相比，iMICC的糾錯(cuò)性能高出6.6倍，卻便宜了26.7倍。
因此，iMICC為建立一個(gè)更為簡便、高效、穩(wěn)定和低成本的工業(yè)化糾錯(cuò)流程奠定了基礎(chǔ)。此外，這也是首次證明了二硫鍵的理性設(shè)計(jì)與搭建可以提高酶活的持久性，該思路為包括DNA糾錯(cuò)酶在內(nèi)的諸多核酸工具酶的提質(zhì)改性提供了有益啟發(fā)。
單細(xì)胞中心張佳博士是該論文的第一作者。該工作由單細(xì)胞中心徐健研究員主持完成，得到了研究所姚禮山研究員團(tuán)隊(duì)、趙廣研究員團(tuán)隊(duì)和聯(lián)川生物技術(shù)公司高曉連教授、李璐璐博士等的幫助。該研究獲得了國家自然科學(xué)青年基金、杰青等項(xiàng)目的支持。（文/圖 張佳）
論文
Zhang, J., Wang, Y. F., Chai, B. H., Wang, J. C., Li, L. L., Liu, M., Zhao, G., Yao, L. S., Gao, X. L., Yin, Y. F., and Xu, J*. (2020). Efficient and low-cost error removal in DNA synthesis by a high-durability MutS. ACS Synthetic Biology.
文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00079
