隨著合成生物學(xué)與基因編輯技術(shù)的發(fā)展，在科學(xué)研究中需要編輯越來(lái)越多的基因，例如為了構(gòu)建特定功能的菌株需要進(jìn)行多輪的基因編輯，而且往往需要通過(guò)不同基因編輯的組合構(gòu)建大量菌株進(jìn)行“試錯(cuò)”篩選。現(xiàn)有基因編輯方法需要引入特定篩選標(biāo)記或者特定抗性的質(zhì)粒來(lái)完成基因編輯，這些篩選標(biāo)記或者質(zhì)粒需要在下一輪基因編輯前去除，從而實(shí)現(xiàn)無(wú)痕編輯或者篩選標(biāo)記的重復(fù)利用。而篩選標(biāo)記或者質(zhì)粒的去除效率很難達(dá)到100% （即會(huì)發(fā)生逃逸），因此在去除標(biāo)記后需要進(jìn)行單克隆的篩選和確認(rèn)。這極大地增加了多輪基因編輯的周期，而且需要更多的培養(yǎng)次數(shù)、增加了基因組自發(fā)突變的風(fēng)險(xiǎn)。
針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，青島能源所咸漠研究員帶領(lǐng)的材料生物合成技術(shù)中心基于“剪刀石頭布”策略實(shí)現(xiàn)了免篩選標(biāo)記/質(zhì)粒消除步驟的多輪基因編輯方法，相關(guān)成果近日發(fā)表于國(guó)際高影響刊物Nucleic Acids Research。本研究構(gòu)建了三個(gè)能夠循環(huán)消除的基因編輯輔助質(zhì)粒（pRock，pPaper，pScissors），在按照“剪刀-石頭-布”順序分別使用這三個(gè)質(zhì)粒實(shí)施基因編輯時(shí)，可以同時(shí)去除上一輪基因編輯中使用的輔助質(zhì)粒，從而免除了傳統(tǒng)方法中的篩選標(biāo)記或者質(zhì)粒消除步驟，極大地提高了多輪編輯的速度（圖1）。質(zhì)粒消除效率可達(dá)到99.99-100%，幾乎不會(huì)有逃逸情況。另外該系統(tǒng)還存在雙重檢查機(jī)制：如上一輪發(fā)生了逃逸的情況，由于質(zhì)粒間的拮抗作用則不能進(jìn)行下一輪編輯。本研究在大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌中對(duì)該方法進(jìn)行了測(cè)試，快速完成了多輪的敲除、插入、替換等基因編輯操作。
利用本方法進(jìn)行連續(xù)多輪基因編輯時(shí)，每一輪編輯僅需要進(jìn)行兩次培養(yǎng)，即一次平板培養(yǎng)和一次單克隆液體培養(yǎng)（圖2），這幾乎是精細(xì)基因編輯所需要的最少培養(yǎng)次數(shù)。這不僅極大地縮短了基因編輯周期，還減少了基因組隨機(jī)突變的可能性，這些優(yōu)勢(shì)在進(jìn)行大規(guī)模多輪基因編輯時(shí)尤為明顯。本方法是目前最快最魯棒的多輪基因編輯策略，可與現(xiàn)有其它CRISPR/Cas9編輯優(yōu)化策略進(jìn)行聯(lián)合使用并且在未來(lái)更易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，同樣策略也可以用于其它物種的基因編輯。
材料生物合成技術(shù)中心博士后王紀(jì)超、碩士研究生隋新悅為本論文的共同第一作者，趙廣研究員和咸漠研究員為本論文共同通訊作者。該工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委、國(guó)防科工局等項(xiàng)目的資助。
圖1. 基于“剪刀石頭布”策略的多基因編輯方法示意圖。A. 三個(gè)能夠循環(huán)消除的基因編輯輔助質(zhì)粒，在實(shí)施基因編輯的同時(shí)能消除上一輪的質(zhì)粒。 B. 相較于傳統(tǒng)方法，本方法不需要單獨(dú)的篩選標(biāo)記或質(zhì)粒消除步驟。
圖2. 基于“剪刀石頭布”策略的多輪基因編輯流程圖。A. “剪刀石頭布”基因編輯輔助質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。B. 連續(xù)多輪基因編輯步驟流程圖。
本研究相關(guān)質(zhì)?？蓮牡谌介_放獲?。?span lang="EN-US">MolecularCloud (www.molecularcloud.org)，MC_0101139, MC_0101140，MC_0101141。建議同時(shí)獲取MC_0000011以及MC_0000012。
原文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkaa1141
Jichao Wang, Xinyue Sui, Yamei Ding, Yingxin Fu, Xinjun Feng, Min Liu, Youming Zhang, Mo Xian, Guang Zhao, A fast and robust iterative genome-editing method based on a Rock-Paper-Scissors strategy, Nucleic Acids Research, 2020, DOI: 10.1093/nar/gkaa1141
