光學(xué)純度的氧化苯乙烯是醫(yī)藥、手性化學(xué)品和功能高分子的重要合成砌塊，烯烴的不對(duì)稱環(huán)氧化是合成該化合物最經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)潔的方法之一。盡管苯乙烯不對(duì)稱環(huán)氧化已取得重要進(jìn)展，然而包括化學(xué)和生物催化在內(nèi)的大多數(shù)體系均以(S)-構(gòu)型手性產(chǎn)物為主。開發(fā)高度(R)-對(duì)映選擇性苯乙烯環(huán)氧化的工程酶仍然具有一定挑戰(zhàn)和重要價(jià)值。
細(xì)胞色素P450單加氧酶是公認(rèn)的多功能生物氧化催化劑，是眾多天然產(chǎn)物生源合成途徑中的限速酶之一，其也能夠催化多種不同類型的烯烴環(huán)氧化反應(yīng)，然而已報(bào)道的野生型P450及其工程酶在苯乙烯環(huán)氧化的(R)-對(duì)映選擇性控制方面均不理想。另外，絕大多數(shù)P450單加氧酶催化功能的實(shí)現(xiàn)高度依賴提供還原力的輔酶NAD(P)H和負(fù)責(zé)電子傳遞的還原伴侶蛋白。鑒于P450酶在合成生物技術(shù)領(lǐng)域的巨大潛力，青島能源所叢志奇研究員帶領(lǐng)的單碳酶催化研究組近年來致力于開發(fā)不依賴于還原輔酶的非天然P450過加氧酶催化系統(tǒng)，在國(guó)際上首次提出“雙功能小分子協(xié)同P450酶催化”的新概念，通過引入帶有內(nèi)嵌堿性基團(tuán)的外源小分子作為助催化位點(diǎn)，協(xié)助P450的血紅素活性中心活化過氧化氫，成功將單加氧酶P450BM3改造為以過氧化氫作為末端氧化劑的P450過加氧酶，為P450催化的非天然底物氧化轉(zhuǎn)化提供了新的策略（Angew. Chem., Int. Ed. 2018, 7628, selected as Very Important Paper and Frontispiece; Chem. Eur. J. 2019, 6853, Invited Concept, selected as Review Showcase and Frontispiece; ACS Catal. 2019, 7350; Catal. Sci. Technol. 2020, 1219, selected as Inside Front Cover）。
與天然P450酶相比，“雙功能小分子協(xié)同的人工P450過加氧酶”具有獨(dú)特的催化特征：1）解除了P450BM3酶工程改造中對(duì)高度保守位點(diǎn)T268的突變限制，T268位于血紅素活性中心的最近端，是天然酶中誘導(dǎo)催化活性中間體形成的關(guān)鍵殘基，同時(shí)其對(duì)底物結(jié)合構(gòu)象有明顯調(diào)節(jié)作用，T268的可突變?yōu)榇呋磻?yīng)的區(qū)域和立體選擇性控制提供了更多的可能；2）雙功能小分子N-(w-咪唑基)-己?；?L-苯丙氨酸衍生物（N-(w-imidazolyl)-hexanoyl-L-phenylalanine, Im-C6-Phe）在發(fā)揮助催化作用的同時(shí)也可調(diào)節(jié)底物的結(jié)合構(gòu)象，進(jìn)而影響反應(yīng)的區(qū)域和立體選擇性。
在上述研究基礎(chǔ)上，研究人員利用P450酶的半理性設(shè)計(jì)和雙功能小分子協(xié)同P450催化策略有機(jī)結(jié)合，通過對(duì)T268位點(diǎn)作用的系統(tǒng)研究及與F87位點(diǎn)的組合突變，并結(jié)合底物空腔周圍位點(diǎn)的迭代突變，實(shí)現(xiàn)了苯乙烯的高度不對(duì)稱環(huán)氧化，(R)-氧化苯乙烯的對(duì)映選擇性可達(dá)99% ee，催化活性同樣十分優(yōu)異，反應(yīng)總轉(zhuǎn)化數(shù)實(shí)現(xiàn)了目前P450過加氧酶催化苯乙烯環(huán)氧化的最優(yōu)性能（圖1）。取代苯乙烯的底物拓展同樣呈現(xiàn)優(yōu)異的不對(duì)稱催化性能，(R)-氯/氟代氧化苯乙烯的對(duì)映選擇性均可實(shí)現(xiàn)95% ee-99% ee。典型突變的半制備量反應(yīng)可保持(R)-氧化苯乙烯的高度對(duì)映選擇性，分離產(chǎn)率達(dá)43%以上。該研究顯示蛋白質(zhì)工程與雙功能小分子協(xié)同P450過加氧酶催化策略組合可為酶促烯烴不對(duì)稱環(huán)氧化提供一條新途徑，拓展了P450酶的催化應(yīng)用范圍。
圖1 雙功能小分子協(xié)同P450過加氧酶催化苯乙烯不對(duì)稱環(huán)氧化反應(yīng)
相關(guān)工作于近日發(fā)表在英國(guó)皇家化學(xué)會(huì)(RSC)的旗艦期刊Chemical Science（影響因子：9.346）上（Chem. Sci. 2021, 12, 6307-6314），并被選為封面文章（Back Cover）。單碳酶催化研究組趙盼霞、陳杰博士為論文共同第一作者，叢志奇研究員為通訊作者。該工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，青島市創(chuàng)新領(lǐng)軍人才計(jì)劃，青島能源所所內(nèi)合作基金以及山東省合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心等的大力支持。
附錄:
Zhao P+, +, Ma N, Chen J, Qin X, Liu C, Yao F, Yao L, Jin L, Cong Z. Enabling highly (R)-enantioselective epoxidation of styrene by engineering unique non-natural P450 peroxygenases. Chemical Science, 2021, 12, 6307-6314.
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