微生物組（又稱菌群）在自然界和人體中無處不在，因此菌群測序在生態(tài)健康診斷、生態(tài)過程監(jiān)控、生物資源挖掘、合成生物學(xué)研究等領(lǐng)域均具廣闊應(yīng)用。針對目前菌群測序方法學(xué)領(lǐng)域面臨的痛點與難點，中科院青島能源所單細(xì)胞中心和中國海洋大學(xué)發(fā)明了一種高物種分辨率、高靈敏性、可同時鑒定所有原核與真核微生物、不懼樣品降解或污染、低成本的微生物組測序技術(shù)(2bRAD-M)。該項成果發(fā)表于國際基因組學(xué)領(lǐng)域權(quán)威期刊Genome Biology。
高效分析痕量降解微生物組的2bRAD-M技術(shù)
IIB型限制性內(nèi)切酶就如同二郎神手中的三尖兩刃戟，在微生物DNA上尋找核心識別位點并同時切割其兩側(cè)翼序列【對應(yīng)“三尖兩刃”】，從而產(chǎn)生大量等長短標(biāo)簽，通過擴(kuò)增、測序及相關(guān)算法計算，可對痕量、高度降解、嚴(yán)重污染的菌群樣本進(jìn)行種水平的細(xì)菌、古菌和真菌鑒定
在微生物組研究中，解析微生物群落的物種構(gòu)成主要依賴于兩種高通量手段：擴(kuò)增子測序（16S/18S/ITS）和鳥槍法宏基因組測序（WMS）。然而目前這兩種主流手段都面臨著關(guān)鍵瓶頸。擴(kuò)增子測序存在擴(kuò)增偏好性、脫靶擴(kuò)增、物種分辨率低等問題，且通常無法同時檢測細(xì)菌、古菌與真菌。鳥槍法測序雖然一定程度上解決了上述問題，但對樣本DNA質(zhì)和量的要求高，故通常難以分析痕量、高度降解或污染嚴(yán)重的樣品，而且測序成本相對很高。因此，亟待開發(fā)一種高物種分辨率、高靈敏性、可同時鑒定所有原核與真核微生物、不懼樣品降解或污染、低成本的微生物組測序技術(shù)。
針對上述瓶頸，青島能源所單細(xì)胞中心孫政博士和黃適博士為核心骨干的研究小組，建立了名為2bRAD-M的 “簡化宏基因組測序技術(shù)”，有效克服了上述擴(kuò)增子測序和鳥槍法測序的核心缺陷，有望作為一種共性的新手段，服務(wù)于人體與環(huán)境中痕量、高度降解或污染嚴(yán)重之菌群樣品的高效解析。
IIB型限制性內(nèi)切酶，是一種能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并在識別位點上游和下游的特定距離進(jìn)行切割，形成等長短片段（20-33 bp）的核酸內(nèi)切酶。作為一種基于IIB型限制性內(nèi)切酶特性的測序技術(shù)，2bRAD目前已經(jīng)被應(yīng)用于包括人體、模式動物、海洋動物等上百個單一物種的基因組研究。但一個菌群通常由成百上千個真菌、細(xì)菌和古菌物種組成，比分析單一物種復(fù)雜得多。
研究人員提出了2bRAD-M技術(shù)的原理：處理菌群總DNA樣本，對IIB酶切片段進(jìn)行擴(kuò)增和測序，然后以各種微生物基因組序列上的理論酶切位點為參照，來推斷菌群結(jié)構(gòu)。為了驗證該技術(shù)，該研究首先通過模擬酶切數(shù)據(jù)，研究了不同來源、相似度或復(fù)雜程度以及不同實驗方法學(xué)對菌群定性和定量分析的影響，并解決了高重復(fù)性短片段DNA干擾序列匹配的問題。其次，通過利用人工和自然菌群樣本，驗證了2bRAD-M的敏感性、重復(fù)性、分辨率、準(zhǔn)確度和偏好性等，進(jìn)而挖掘了該方法用于各種實際菌群樣品之測序的潛力和局限性。
具體來說，研究人員證明，該技術(shù)能夠有效處理低生物量菌群樣本，例如，針對總DNA僅為1 pg、長度僅有50 bp的高度片段化、或99%被宿主DNA污染的人工菌群DNA樣本，2bRAD-M均能得到種水平、高度準(zhǔn)確、同時涵蓋細(xì)菌、古菌和真菌的菌群結(jié)構(gòu)的定性與定量分析結(jié)果。針對皮膚，腸道和環(huán)境等實際樣本，2bRAD-M同樣表現(xiàn)出色。針對臨床最常見、但菌群DNA極為微量且高度降解或污染的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，該研究發(fā)現(xiàn)，僅用極微量的FFPE切片樣本（3 cm 2 m），2bRAD-M就能捕捉到潛在可服務(wù)宮頸癌診斷的微生物物種標(biāo)識物。這些發(fā)現(xiàn)，對于腫瘤微生物組、免疫組織微生物組等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究與臨床實踐，具有重要的方法學(xué)意義。
該工作由單細(xì)胞中心徐健研究員與中國海洋大學(xué)王師教授主持完成，青島歐易生物深度參與了技術(shù)研發(fā)并提供了重要技術(shù)支持，獲得了國家自然科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃、中國博士后科學(xué)基金、山東省人才工程項目的資助，并得到寶潔公司的技術(shù)支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1186/s13059-021-02576-9
Zheng Sun#, Shi Huang*#, Pengfei Zhu, Lam Tzehau, Helen Zhao, Jia Lv, Rongchao Zhang, Lisha Zhou, Qianya Niu, Xiuping Wang, Meng Zhang, Gongchao Jing, Zhenmin Bao, Jiquan Liu, Shi Wang*, Jian Xu*. Species-resolved sequencing of low-biomass or degraded microbiomes using 2bRAD-M. Genome Biology, 2022, 23:36.
