近日，大連化物所分子探針與熒光成像研究組（1818組）徐兆超研究員團隊發(fā)展了在酸性條件下，可自閃爍的單分子定位超分辨成像熒光探針LysoSR-549，實現(xiàn)了在12nm/20ms時空分辨率下，長達(dá)40分鐘的全細(xì)胞溶酶體解析。
長時間超分辨熒光成像對于揭示納米尺度的細(xì)胞器動力學(xué)和功能越來越重要，但由于缺乏高度光穩(wěn)定和環(huán)境敏感的熒光探針為研究工具，一直以來，科研人員對細(xì)胞器互作網(wǎng)絡(luò)的功能和調(diào)節(jié)機制，尤其是細(xì)胞器納米級全景分布和時空過程所知尚少。
溶酶體是多功能細(xì)胞器，在降解生物分子、介導(dǎo)細(xì)胞代謝和細(xì)胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。溶酶體功能障礙在溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病和癌癥中的作用也已得到證實，使得溶酶體成為疾病治療靶點之一。溶酶體多重功能是通過溶酶體與其他細(xì)胞器的融合或接觸來實現(xiàn)，并由溶酶體動力學(xué)介導(dǎo)，包括溶酶體的運動、溶酶體數(shù)量、大小、形態(tài)和腔內(nèi)酸性變化等。越來越多的證據(jù)表明，每個具有不同位置、運動軌跡和化學(xué)成分的溶酶體都具有特定的功能；但溶酶體又同時受到系統(tǒng)水平上的調(diào)節(jié)，以溶酶體簇等集體行為在整個細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能。破譯全細(xì)胞溶酶體的空間分布、化學(xué)成分和動力學(xué)可以了解和發(fā)現(xiàn)溶酶體的多功能和作用網(wǎng)絡(luò)，解析溶酶體個體功能與系統(tǒng)調(diào)控之間的關(guān)系。但溶酶體腔內(nèi)是pH為4.5至5的酸性環(huán)境，使得熒光探針無法在此條件下實現(xiàn)長時間的時空超分辨和對溶酶體酸性的動態(tài)識別。
本工作中，該團隊將鄰甲基吡啶引入到羅丹明螺酰胺中，開發(fā)了自閃爍探針LysoSR-549。研究發(fā)現(xiàn)，吡啶與異吲哚啉酮處于平面結(jié)構(gòu)，并且吡啶N與羰基處于反式構(gòu)型。由于吡啶的堿性大于羰基，因此在弱酸性下，質(zhì)子優(yōu)先與吡啶N結(jié)合而遠(yuǎn)離羰基；隨著酸度的增加，吡啶環(huán)旋轉(zhuǎn)，質(zhì)子同時與羰基結(jié)合，使pH在4.5至5范圍內(nèi)的少量染料發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，形成熒光兩性離子；隨后又與呫噸環(huán)10號位-C發(fā)生親核加成反應(yīng)，迅速恢復(fù)為不發(fā)熒光的螺內(nèi)酰胺，從而完成一次閃爍過程。
基于上述反應(yīng)機理，LysoSR-549自閃爍參數(shù)pKcycl被降低到3.2，使其能夠在溶酶體pH下進行單分子定位超分辨成像（SMLM），并達(dá)到了12nm/20ms時空分辨率，這是目前所報道的溶酶體超分辨成像中最高的定位精度。同時，溶酶體內(nèi)負(fù)載了大量的探針，由于只有少數(shù)探針處于閃爍發(fā)光狀態(tài)，這就賦予了探針緩沖能力來抵抗光漂白，使得LysoSR-549呈現(xiàn)出較好的光穩(wěn)定性，實現(xiàn)了40分鐘的長時間超分辨率成像，從而在單個溶酶體分辨的水平上解析了全細(xì)胞內(nèi)所有溶酶體的運動軌跡，包括觀察到最長運動距離可達(dá)50 m，最快運動速度可達(dá)0.31 m/s。該探針的單分子光子數(shù)與pH值呈線性關(guān)系，從而可以在單分子成像過程中識別每個溶酶體pH值，最終實現(xiàn)了單個溶酶體解析水平上，同時分辨整個細(xì)胞中所有溶酶體的動態(tài)和腔內(nèi)pH，并根據(jù)溶酶體分布、大小和腔內(nèi)pH值來分辨出全細(xì)胞溶酶體亞群。
LysoSR-549所具備的解析全細(xì)胞溶酶體的能力，使得立體可視化追蹤和分辨溶酶體成為可能，從而可以發(fā)現(xiàn)很多之前未知的溶酶體化學(xué)和生物學(xué)信息，破解溶酶體的生物化學(xué)。團隊實現(xiàn)了對整個細(xì)胞的所有溶酶體跨時間尺度追蹤，也可以聚焦在某一局部，或某一個溶酶體來做研究。
此外，該團隊還對不同外界刺激下的全細(xì)胞溶酶體進行了分析，發(fā)現(xiàn)不同條件下溶酶體的大小、數(shù)量、分布、動力學(xué)和腔內(nèi)pH值均有顯著差異，這可望對溶酶體相關(guān)疾病診斷提供新的方法。
相關(guān)研究成果以“An Acid-regulated Self-blinking Fluorescent Probe for Resolving Whole-cell Lysosomes with Long-term Nanoscopy”為題，于近日發(fā)表在《德國應(yīng)用化學(xué)》（Angew. Chem. Int. Ed.）上。該工作的第一作者是大連化物所1818組喬慶龍副研究員。上述工作得到國家自然科學(xué)基金、大連化物所創(chuàng)新基金等項目的資助。
