持留菌（persisters）能夠在致死濃度的抗生素環(huán)境中存活，并在停藥后恢復(fù)生長(zhǎng)繁殖，是慢性感染和感染復(fù)發(fā)的重要原因，但是其代謝特性一直難以捉摸。近期，青島能源所和香港大學(xué)合作開(kāi)發(fā)單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)，在單菌體精度揭示了持留菌的代謝特征。該研究最近發(fā)表在 Frontiers in Microbiology《微生物學(xué)前沿》。
“持留”（persistence）現(xiàn)象在微生物世界中普遍存在。在抗生素或其他環(huán)境條件的脅迫下，一個(gè)微生物群體中的極小部分成員，會(huì)進(jìn)入“停止生長(zhǎng)但仍然保留一定代謝活性”的休眠狀態(tài)，從而度過(guò)極端環(huán)境的脅迫。在抗生素用藥期間產(chǎn)生的持留菌，往往在診斷和治療中成為“漏網(wǎng)之魚(yú)”，將在停藥后恢復(fù)生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致感染復(fù)發(fā)和慢性感染。在臨床抗感染用藥與藥物開(kāi)發(fā)中，如何識(shí)別與表征持留菌一直是業(yè)界高度關(guān)注的關(guān)鍵問(wèn)題。
單細(xì)胞拉曼光譜能夠表征細(xì)胞的底物代謝、產(chǎn)物合成、藥敏性、環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)等關(guān)鍵代謝功能。因此，香港大學(xué)牙醫(yī)學(xué)院博士王川和單細(xì)胞中心博士生陳榮澤組成的聯(lián)合研究小組，利用單細(xì)胞拉曼光譜剖析了大腸桿菌（Escherichia coli）細(xì)胞群體在氨芐西林（一種臨床常用的廣譜抗生素）作用下的應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌持留菌的三個(gè)特性。
第一，在藥物刺激后和早期復(fù)蘇過(guò)程中，與同期未經(jīng)藥物刺激的大腸桿菌（非持留狀態(tài)）相比，持留菌的單細(xì)胞拉曼光譜全譜存在顯著差異，有助于識(shí)別持留狀態(tài)的細(xì)菌單細(xì)胞。
第二，基于重水飼喂單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)，通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)菌群體應(yīng)激抗生素的代謝活性變化，研究人員發(fā)現(xiàn)，在總共長(zhǎng)達(dá)8小時(shí)藥物應(yīng)激過(guò)程中，在藥物處理4個(gè)小時(shí)后，持留菌的代謝活性卻顯著高于同期的非持留狀態(tài)細(xì)胞（未經(jīng)藥物刺激）。而且在持留菌細(xì)胞內(nèi)，脂質(zhì)、多糖和大多數(shù)與蛋白質(zhì)相關(guān)的拉曼信號(hào)（除酰胺外）均有所增強(qiáng)，表明持留菌比同期的非持留狀態(tài)細(xì)胞更快地積累了更多的儲(chǔ)能物質(zhì)。另一方面，這些持留菌細(xì)胞的核酸含量卻明顯降低，這表明盡管其代謝活性較高，持留菌進(jìn)入分裂周期的過(guò)程卻受到顯著抑制。
第三，通過(guò)人工模擬一個(gè)完整的抗生素用藥過(guò)程（藥物處理4小時(shí)，停藥培養(yǎng)4小時(shí)），研究人員發(fā)現(xiàn)，停止用藥之后的4小時(shí)內(nèi)，即持留菌“復(fù)蘇階段”的早期，持留菌始終保持恒定的代謝速率。然而奇怪的是，該代謝速率卻顯著低于對(duì)照組（繼續(xù)用藥）中的持留菌，而且也低于同期的非持留狀態(tài)細(xì)胞（未經(jīng)藥物處理）。下一步，研究人員將深入挖掘持留菌在復(fù)蘇階段這些代謝特征的分子機(jī)制。
上述新發(fā)現(xiàn)有助于理解微生物持留現(xiàn)象的產(chǎn)生和持留菌復(fù)蘇的機(jī)制，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)持留菌診斷技術(shù)提供了重要線索。結(jié)合單細(xì)胞中心研制的臨床單細(xì)胞拉曼藥敏快檢儀（CAST-R）和單細(xì)胞拉曼分選-測(cè)序-培養(yǎng)系統(tǒng)（RACS-Seq/Culture），該合作團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新方法，深化細(xì)菌-藥物互作機(jī)制的研究，并為臨床抗生素精準(zhǔn)使用提供科學(xué)依據(jù)。
本研究工作由香港大學(xué)牙醫(yī)學(xué)院金力堅(jiān)教授和單細(xì)胞中心徐健研究員共同主持完成。該研究項(xiàng)目獲得了中科院先導(dǎo)專項(xiàng)、基金委國(guó)家重大科學(xué)儀器研制項(xiàng)目、中科院STS區(qū)域重點(diǎn)項(xiàng)目、香港研究資助局、香港大學(xué)明德教授席基金的資助。
單細(xì)胞拉曼光譜可“揪出”持留菌，并在單菌體精度揭示其代謝特征
Chuan Wang#, Rongze Chen#, Jian Xu*, Lijian Jin*. Single-cell Raman spectroscopy identifies Escherichia coli persisters and reveals their enhanced metabolic activities. Frontiers in Microbiology 2022, 13:936726.
