大黃素甲醚是一種已經(jīng)上市的植物源生物農(nóng)藥，可用于植物白粉病、霜霉病、灰霉病和炭疽病等植物病害的防治，該項技術(shù)開發(fā)單位曾先后榮獲2014年國家科學進步二等獎和2015年中國發(fā)明專利金獎。目前，大黃素甲醚需要從中藥大黃中提取，存在諸多弊端，如植物生長條件苛刻且緩慢、化合物豐度低分離難等，推高其生產(chǎn)成本的同時降低了工藝的經(jīng)濟性，嚴重限制了大黃素甲醚市場推廣。
利用基因工程技術(shù)定向改造微生物合成、代謝途徑積累目標中間體化學品，或者基于合成生物學理念全新設(shè)計構(gòu)建新的細胞工廠高效生產(chǎn)植物源天然產(chǎn)物成為新的研究熱門領(lǐng)域。近日，青島能源所微生物制造工程中心開發(fā)了一種全新的大黃素甲醚微生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝，相關(guān)成果已發(fā)表于代謝工程領(lǐng)域權(quán)威期刊Metabolic Engineering《代謝工程》。
土曲霉中有一個地曲霉素生物合成途徑，大黃素是其關(guān)鍵中間體化合物。為了實現(xiàn)大黃素甲醚的土曲霉合成，該研究團隊首先利用過表達轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GedR成功實現(xiàn)了地曲霉素生物合成基因簇的激活，產(chǎn)生了一系列大黃素及其下游代謝衍生物；進而通過關(guān)鍵O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因gedA的敲除，實現(xiàn)了前體化合物大黃素的高效積累。在此基礎(chǔ)上，多種策略并舉挖掘大黃素-3-羥基-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，并通過體外酶活實驗進行驗證，最終獲得了六個潛在的酶學元件；進一步通過代謝工程改造將候選酶基因?qū)敫弋a(chǎn)大黃素的土曲霉底盤中，最終構(gòu)建了大黃素甲醚高產(chǎn)的土曲霉細胞工廠，并進行了百升級發(fā)酵放大，產(chǎn)量達到6.3g/L。
圖1. 大黃素甲醚生產(chǎn)工藝
?。ˋ）傳統(tǒng)植物種植提取生產(chǎn)工藝；（B）新型合成生物技術(shù)構(gòu)建微生物細胞工廠的發(fā)酵生產(chǎn)工藝
該項技術(shù)首次實現(xiàn)了植物源殺菌劑大黃素甲醚的微生物高效合成，基于現(xiàn)階段技術(shù)指標，只需要一個200噸的發(fā)酵罐年產(chǎn)量即可覆蓋我國每年種植10萬畝大黃的大黃素甲醚產(chǎn)能，有望實現(xiàn)從傳統(tǒng)植物種植提取到現(xiàn)代微生物發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)的變革。該項技術(shù)已經(jīng)與山東魯抗醫(yī)藥完成技術(shù)轉(zhuǎn)讓，通過共建產(chǎn)研合作平臺推動研究成果從實驗室走向工廠車間，打造大黃素甲醚微生物發(fā)酵生產(chǎn)新模式，降低成本、提高產(chǎn)能，為市場推廣開發(fā)奠定基礎(chǔ)。更值得一提的是，這是一個構(gòu)建微生物細胞生產(chǎn)植物源天然產(chǎn)物的成功案例，可以為植物源天然產(chǎn)物的微生物發(fā)酵合成提供有效借鑒。
青島能源所呂雪峰研究員和黃雪年研究員為本論文的共同通訊作者，副研究員齊飛飛和博士研究生張偉為論文的共同第一作者。本研究獲得了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、山東省人才計劃及山東省重點研發(fā)計劃的支持。
Feifei Qi#, Wei Zhang#, Yingying Xue, Ce Geng, Zhigang Jin, Jibin Li, Qiang Guo, Xuenian Huang*, Xuefeng Lu*, Microbial production of the plant-derived fungicide physcion. Metab. Eng. 74, 130-138 (2022).
專利：201910649852.6 201910650149.7 2021107066086 2021107053531 2021107072392 2021107058893
