萜烯化合物，既包括大宗化學(xué)品異戊二烯又包括高能量密度燃料蒎烯等，在材料、能源和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價(jià)值。以可再生糖為原料，利用綠色可持續(xù)的微生物代謝工程合成萜類(lèi)物質(zhì)是當(dāng)前生物化工領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，其中微生物可利用的外源甲羥戊酸（MVA）途徑因其高效性和較好的可調(diào)控性是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。MVA途徑從前體乙酰輔酶A到二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的合成路線(xiàn)涉及到7步反應(yīng)和7個(gè)酶，如何突破限制該途徑效率的點(diǎn)并平衡協(xié)調(diào)這7個(gè)酶的合成路線(xiàn)，從而提升代謝效率、平衡代謝流，同時(shí)防止中間產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒性，是該途徑的突破點(diǎn)和難題。
圖1. 代謝限制性位點(diǎn)MK的定向進(jìn)化策略和效果圖
青島能源所生物基材料組群張海波研究員帶領(lǐng)的精細(xì)化學(xué)品研究組長(zhǎng)期致力于萜烯化合物的生物合成，重點(diǎn)針對(duì)MVA途徑的酶甲羥戊酸激酶（MK）、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（IDI）和萜烯合成酶等幾個(gè)限制性點(diǎn)，同時(shí)統(tǒng)籌代謝流和中間產(chǎn)物毒性，平衡整條合成路線(xiàn)，在點(diǎn)線(xiàn)結(jié)合提升萜類(lèi)化合物合成的MVA途徑的效率上取得了新的突破。首先，針對(duì)MVA途徑中的MK和IDI，通過(guò)不同物種來(lái)源篩選、隨機(jī)突變和半理性設(shè)計(jì)進(jìn)行定向進(jìn)化和優(yōu)化，獲得了酶活性提高的MK（RSC Advances, 2018）和IDI (Microbial Cell Factories, 2018)，從而減弱代謝流在MK和IDI位點(diǎn)的阻滯，最終提高萜烯化合物的產(chǎn)量（圖1 MK的定向進(jìn)化策略和效果圖）。其次，統(tǒng)籌MVA途徑涉及到的多步反應(yīng)，對(duì)酶表達(dá)量的調(diào)控涉及的多個(gè)水平。該研究選取翻譯水平上的調(diào)控方法，避免了RNA的不穩(wěn)定和翻譯后水平調(diào)控的菌體代謝負(fù)擔(dān)問(wèn)題，通過(guò)調(diào)整不同酶的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）序列的手段，調(diào)控不同酶的表達(dá)，平衡整條代謝路線(xiàn)。對(duì)非限制酶羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（MvaE）和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因（ERG19），調(diào)節(jié)其RBS序列，使其翻譯起始效率（T.I.R.）降低，降低其蛋白表達(dá)量。對(duì)限制性酶MK和IDI，調(diào)節(jié)其RBS序列，使其T.I.R.提高，提高其蛋白表達(dá)量。通過(guò)對(duì)甲羥戊酸途徑中的不同的酶的蛋白表達(dá)量的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了代謝流的平衡，最終提高了萜烯化合物的產(chǎn)量（圖2 非限制酶和限制酶RBS序列優(yōu)化策略）。
圖2 非限制酶和限制酶RBS序列優(yōu)化策略
上述研究獲得了中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)、國(guó)家自然科學(xué)基金、泰山學(xué)者攀登計(jì)劃等項(xiàng)目資助。（文/圖 李美潔 陳海林 張海波）
相關(guān)成果發(fā)表：
[1] Chen H, Li M, Liu C, Zhang H, Xian M, Liu H: Enhancement of the catalytic activity of Isopentenyl diphosphate isomerase (IDI) from Saccharomyces cerevisiae through random and site-directed mutagenesis. Microbial Cell Factories 2018, 17(1). Doi: 10.1039/c8ra01783b
[2] Chen H, Liu C, Li M, Zhang H, Xian M, Liu H: Directed evolution of mevalonate kinase in Escherichia coli by random mutagenesis for improved lycopene. RSC Advances 2018, 8(27):15021-15028. Doi: 10.1186/s12934-018-0913-z
[3] Li M, Nian R, Xian M, Zhang H: Metabolic engineering for the production of isoprene and isopentenol by Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology 2018, Doi:10.1007/s00253-018-9200-5.
[4] Li M, Liu C, Chen H, Deng L, Zhang H, Nian R, Xian M: Biochemical characterization of isoprene synthase from Ipomoea batatas. Journal of Bioscience and Bioengineering 2018, Accepted.
