單個(gè)細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單元，也是生物進(jìn)化的基本單位。因此單細(xì)胞技術(shù)正在推動(dòng)生命起源、細(xì)胞功能異質(zhì)性機(jī)制、生命暗物質(zhì)挖掘與利用等領(lǐng)域的一系列重大突破。單細(xì)胞拉曼光譜（SCRS）能非標(biāo)記、非侵入性、無(wú)損、全景式地揭示細(xì)胞代謝狀態(tài)，因此基于拉曼光譜的單細(xì)胞分選（Raman-Activated Cell Sorting，RACS），在單細(xì)胞技術(shù)體系中有著廣闊的應(yīng)用前景（Biotechnol Adv，2019）。但是，拉曼譜圖采集時(shí)間長(zhǎng)、分選通量低等問(wèn)題，限制了RACS的廣泛應(yīng)用。針對(duì)這些關(guān)鍵瓶頸，青島能源所單細(xì)胞中心發(fā)明了基于介電單細(xì)胞捕獲/釋放的拉曼激活液滴分選技術(shù)pDEP-RADS，并研制成功國(guó)內(nèi)外首臺(tái)高通量流式拉曼分選儀產(chǎn)品樣機(jī)FlowRACS。利用FlowRACS，首次示范了基于分子光譜、非標(biāo)記式、單細(xì)胞精度、高通量流式的酶活篩選，為酶資源的探測(cè)和挖掘開(kāi)辟了一個(gè)全新的技術(shù)路線。該工作近日發(fā)表于《科學(xué)進(jìn)展》（Science Advances）。
開(kāi)發(fā)首臺(tái)高通量流式拉曼分選儀FlowRACS，服務(wù)高通量酶篩選
一個(gè)微生物細(xì)胞的體積通常只有一個(gè)人體細(xì)胞的千分之一。在高速液流中，針對(duì)這么微小的細(xì)胞，如何精確捕獲、采集高質(zhì)量全譜拉曼并實(shí)現(xiàn)高通量分選，一直是業(yè)界的重點(diǎn)和難點(diǎn)。針對(duì)上述問(wèn)題，青島能源所單細(xì)胞中心王喜先、辛一、任立輝等帶領(lǐng)的研究小組發(fā)明了“介電單細(xì)胞捕獲/釋放拉曼激活液滴分選技術(shù)”pDEP-RADS（Positive dielectrophoresis based Raman-activated droplet sorting；圖1）。通過(guò)周期性施加介電場(chǎng)，確保高速流動(dòng)的單細(xì)胞被精確捕獲在拉曼激光位點(diǎn)，以允許高質(zhì)量拉曼譜圖的采集；進(jìn)而單細(xì)胞經(jīng)液滴包裹，借助介電實(shí)現(xiàn)目標(biāo)單細(xì)胞微液滴的高通量分選。
在此關(guān)鍵技術(shù)突破的基礎(chǔ)上，研究人員研制成功首臺(tái)高通量流式拉曼分選儀FlowRACS。研究人員采用低拉曼背景石英玻璃為微流控芯片基材，以提高表型檢測(cè)的普適性；以氧化銦錫（而非金屬）加工電極陣列，以避免光熱損傷；采用先拉曼檢測(cè)后液滴包裹、液滴產(chǎn)生和分選同步進(jìn)行的策略，避免了液滴對(duì)拉曼信號(hào)采集的影響，從而提高檢測(cè)準(zhǔn)確率并簡(jiǎn)化系統(tǒng)操作；最后通過(guò)自主開(kāi)發(fā)的QSpec軟件，實(shí)現(xiàn)了平臺(tái)的自動(dòng)化運(yùn)行。
新陳代謝是一切生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，而新陳代謝離不開(kāi)酶的催化作用。因此，酶是最主要的生物資源之一，也是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要載體。例如，甘油三酯（TAG）是人體、動(dòng)物和植物中油脂的主要成分，它具有極高的能量存儲(chǔ)密度，而且在幾乎所有細(xì)胞中都存在，因此是自然界的“能量存儲(chǔ)貨幣”。細(xì)胞中TAG生物合成的最后一步和限速步驟，是二?；视王；D(zhuǎn)移酶（DGATs）。自然界中DGATs的功能極其多樣，其活性不僅調(diào)控TAG產(chǎn)物的合成效率，還控制著其飽和度、碳鏈長(zhǎng)度等；這些理化性質(zhì)決定了TAG的用途和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，例如是適合做營(yíng)養(yǎng)品還是生物燃油。因此，作為油脂分子設(shè)計(jì)的關(guān)鍵工具，DGATs 的挖掘和篩選具有重大的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。
但是，傳統(tǒng)的DGATs篩選方法通常包括候選酶基因在底盤(pán)細(xì)胞中的表達(dá)、細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)以積累足夠生物質(zhì)、從生物質(zhì)中提取并通過(guò)薄層層析法分離TAG產(chǎn)物、用氣相和液相質(zhì)譜來(lái)分析和定量TAG中組分等繁雜步驟。這一流程通常需要一周時(shí)間，既耗時(shí)耗力，而且難以分析生長(zhǎng)緩慢或尚難培養(yǎng)的細(xì)胞。業(yè)界也嘗試用尼羅紅等熒光染料來(lái)標(biāo)記細(xì)胞中油脂，然后通過(guò)流式細(xì)胞熒光分選儀（FACS）分選細(xì)胞，但是熒光染料特異性低、難以定量分析、細(xì)胞壁對(duì)染料的通透性低或不可控、油脂飽和度無(wú)法表征等瓶頸問(wèn)題仍然沒(méi)有解決。
針對(duì)這些瓶頸問(wèn)題，單細(xì)胞中心“另辟蹊徑”，提出了利用以拉曼為代表的分子光譜來(lái)篩選酶促反應(yīng)活性的新思路。利用FlowRACS，單細(xì)胞中心首次在單個(gè)微生物細(xì)胞精度，實(shí)現(xiàn)了DGATs（在人體、動(dòng)物和植物中催化油脂的合成）體內(nèi)活性的非標(biāo)記式、高通量、高準(zhǔn)確率、無(wú)損分選。針對(duì)來(lái)源于微擬球藻的候選DGAT基因庫(kù)，僅通過(guò)為時(shí)僅10分鐘的FlowRACS運(yùn)行，就成功獲得3個(gè)已報(bào)道的強(qiáng)效基因和2個(gè)從未報(bào)道過(guò)的弱效基因。而前期基于傳統(tǒng)方法對(duì)這3個(gè)強(qiáng)功能基因的篩選和表征，歷時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)月時(shí)間。
與基于生物質(zhì)提取和質(zhì)譜分析的胞內(nèi)油脂分析方法相比，F(xiàn)lowRACS的篩選時(shí)間、試劑耗材和人工成本僅為其百分之一，大大提高了酶的篩選效率。與FACS相比，F(xiàn)lowRACS不再需要針對(duì)酶的底物或產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，可同時(shí)定量表征油脂含量和飽和度等多種關(guān)鍵的酶活指標(biāo)，而且具有更高的檢測(cè)靈敏度和更寬的動(dòng)態(tài)范圍。此外，能夠熒光標(biāo)記的底盤(pán)細(xì)胞很有限，而FlowRACS適用于任何細(xì)胞，這一特色對(duì)于從菌群等尚難培養(yǎng)微生物中直接挖掘酶和細(xì)胞工廠等生物資源來(lái)說(shuō)，具有特別重要的意義。
突破國(guó)產(chǎn)科學(xué)儀器產(chǎn)業(yè)化瓶頸，推動(dòng)原創(chuàng)高端生命科學(xué)儀器產(chǎn)業(yè)發(fā)展
近年來(lái)，在科研人員的努力與國(guó)家政策的支持下，我國(guó)高端科學(xué)儀器研制取得了積極的進(jìn)展，但是僅僅是“追趕”和“并行”的發(fā)展方式并不能夠從根本上扭轉(zhuǎn)高端儀器依賴進(jìn)口的現(xiàn)狀。放眼中國(guó)各大科研院所、高校和企業(yè)研發(fā)中心的實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)口儀器、尤其是高端進(jìn)口儀器仍然占據(jù)著數(shù)量與經(jīng)費(fèi)的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。一旦遭遇國(guó)外的技術(shù)封鎖，我國(guó)的科學(xué)研究將遭遇無(wú)源之水、無(wú)米之炊的窘境，科技發(fā)展將面臨前所未有的困局。
然而，科學(xué)儀器產(chǎn)業(yè)卻是我國(guó)科技鏈條的最短板之一。全球科學(xué)儀器公司20強(qiáng)中，國(guó)產(chǎn)儀器公司無(wú)一上榜。2019年美國(guó)儀器行業(yè)巨頭賽默飛、丹納赫、安捷倫的全年收入分別達(dá)到255.4億美元、179.1億美元和51.6億美元，而排名最靠前的國(guó)產(chǎn)儀器廠商同期營(yíng)業(yè)收入僅僅為7.34億美元。與此同時(shí)，2020年全球單細(xì)胞分析市場(chǎng)規(guī)模估計(jì)為26.8億美元，預(yù)計(jì)在2019至2026年以16.9%的年復(fù)合增長(zhǎng)率增長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)規(guī)模預(yù)計(jì)35億人民幣。強(qiáng)大的市場(chǎng)需求以及市場(chǎng)占有率狹小的局面，對(duì)國(guó)產(chǎn)單細(xì)胞分析儀器的研制和產(chǎn)業(yè)化提出了巨大的挑戰(zhàn)，同時(shí)也帶來(lái)了前所未有的機(jī)遇。
基于pDEP-RADS技術(shù)，單細(xì)胞中心推出了國(guó)內(nèi)外首臺(tái)全譜分選通量達(dá)到600個(gè)細(xì)胞/分鐘的高通量流式拉曼分選儀產(chǎn)品樣機(jī)FlowRACS。FlowRACS具有完全自主的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，已于今年6月份完成了現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)驗(yàn)收。單細(xì)胞中心長(zhǎng)期致力于微生物單細(xì)胞技術(shù)和裝備的研制和產(chǎn)業(yè)化，前期已經(jīng)陸續(xù)研制成功并產(chǎn)業(yè)化臨床單細(xì)胞拉曼藥敏快檢儀（CAST-R）、單細(xì)胞拉曼分選-測(cè)序耦合系統(tǒng)（RACS-Seq）、積木式單細(xì)胞微液滴快速顯微分選系統(tǒng)（EasySort）等單細(xì)胞分析儀器系列產(chǎn)品。做為該儀器系列的最新成員，F(xiàn)lowRACS的研制成功和應(yīng)用拓展，將為單細(xì)胞科學(xué)與產(chǎn)業(yè)提供一個(gè)全新的研究工具，并推動(dòng)我國(guó)細(xì)胞科學(xué)高端儀器產(chǎn)業(yè)的自主創(chuàng)新。
上述工作由單細(xì)胞中心馬波研究員和徐健研究員主持完成，并得到了國(guó)家合成生物學(xué)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家重大科學(xué)儀器研制項(xiàng)目、山東能源研究院、青島星賽生物科技有限公司等的支持。
圖1單細(xì)胞中心研制的pDEP-RADS技術(shù)及儀器系統(tǒng)
附錄：
Xixian Wang#, Yi Xin#, Lihui Ren#, Zheng Sun, Pengfei Zhu, Yuetong Ji, Chunyu Li, Jian Xu*, and Bo Ma*, Positive dielectrophoresis based Raman-activated droplet sorting for culture-free and label-free screening of enzyme function in vivo, Sci. Adv, 2020, DOI: 10.1126/sciadv.abb3521
Yuehui He#, Xixian Wang#, Bo Ma*, Jian Xu*, Ramanome Technology Platform for Label-free Screening and Sorting of Microbial Cell Factories at Single-cell Resolution. Biotechnol. Adv, 2019, DOI: 10.1016/j.biotechadv.2019.04.010.
