烷基酚是抗氧化劑、洗滌劑、聚合材料、潤滑劑、乳化劑、殺蟲劑和藥物等多種化學(xué)品生產(chǎn)中的重要前體。與此同時，烷基酚亦是重點環(huán)境污染物，對動物和人類具有顯著毒性和致癌性。烷基酚側(cè)鏈的碳氫鍵選擇性氧化一方面對這些環(huán)境污染物的生物降解具有重要作用，另一方面對其通過結(jié)構(gòu)衍生化生成心血管疾病治療藥物美多心安，植物天然藥物天麻素、紅景天苷等高值精細化學(xué)品也是意義非凡。
近期，青島能源所李盛英團隊攜手中國科學(xué)院微生物研究所劉雙江課題組，基于前期從谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）中鑒定的對甲酚（p-cresol）生物降解相關(guān)基因簇“cre”，通過體外實驗對該基因簇編碼的CreCDEFGHI七個編碼蛋白的催化功能和酶學(xué)特性進行了較為透徹的研究，并成功實現(xiàn)了整條降解途徑的體外重建。首先，對甲酚被雙亞基磷酸化酶CreHI轉(zhuǎn)化為4-甲基苯基磷酸；然后，4-甲基苯基磷酸的甲基被一種多功能細胞色素P450氧化系統(tǒng)CreJEF連續(xù)氧化，生成磷酸化的醇、醛、酸中間產(chǎn)物；最終，上述磷酸化中間產(chǎn)物被磷酸水解酶CreD水解分別生成對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲酸；對羥基苯甲酸可進入微生物中心代謝而被完全降解利用。此外，“cre”基因簇中還含有1個醇脫氫酶（CreG）和1個醛脫氫酶（CreC），這兩個酶的存在進一步加強了對甲酚的降解效率。
在對甲酚降解過程中，Cre生物催化系統(tǒng)所展示的磷酸基團“裝載”（CreHI）、磷酸化中間體氧化（CreJEF、CreG和CreC）和磷酸基團“卸載”（CreD）與化學(xué)氧化策略通常采用的基團保護、中間體氧化和基團去保護的整個過程不謀而合。這種“仿化”（chemomimetic）生物催化方式在自然界中極為罕見，如能將這一策略的普適性與生物氧化的高選擇性結(jié)合起來，將為“碳氫鍵選擇性氧化”這一世界性難題做出重要貢獻。
為了拓寬這一生物催化系統(tǒng)的底物選擇性，李盛英團隊與所內(nèi)馮銀剛團隊合作，首先對該系統(tǒng)的核心催化劑—P450單加氧酶CreJ與其底物對甲酚進行了共晶解析。在充分理解CreJ催化機理和底物選擇性的基礎(chǔ)之上，我們選取了10種不同類型的烷基酚進行選擇性氧化，發(fā)現(xiàn)該生物催化系統(tǒng)可以成功實現(xiàn)對位和間位取代烷基酚的選擇性氧化，催化過程涉及羥化、脫氫和碳碳鍵斷裂等多種氧化反應(yīng)類型。其中，CreJ催化的對乙酚和間乙酚的芐位羥化實現(xiàn)了完美的立體選擇性，這在化學(xué)催化上是極難實現(xiàn)的。以對乙酚為案例，我們通過共晶結(jié)構(gòu)解析完美地闡釋了CreJ位點和立體選擇性的分子基礎(chǔ)；通過調(diào)控反應(yīng)條件，我們還成功實現(xiàn)了對乙酚多種氧化產(chǎn)物的選擇性合成。
值得一提的是，上述“仿化”生物催化系統(tǒng)不僅能夠?qū)ν榛舆M行選擇性氧化，而且還能實現(xiàn)非芳碳鏈的選擇性氧化，因而具有良好的底物寬泛性，具有廣闊的實際應(yīng)用前景。此外，生物信息學(xué)分析顯示類似的生物催化系統(tǒng)存在于多種微生物中，這將為未來進一步開發(fā)具有所需底物偏好性、氧化選擇性和催化效率的生物系統(tǒng)氧化提供了更廣泛的來源。
本工作由青島能源所“十三五重點培育方向”團隊合作完成，得到了國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金（NSFC 31422002）與面上項目（NSFC 31270784）、山東省自然科學(xué)杰出青年基金（JQ201407）、中科院前沿重點研究計劃（QYZDB-SSW-SMC042）及科技部973計劃（2012CB7211-04）的支持，相關(guān)成果目前已發(fā)表于Journal of Biological Chemistry與Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America雜志。（文/圖 李盛英 杜磊）
1. Lei Du, Li Ma, Feifei Qi, Xianliang Zheng, Chengying Jiang, Ailei Li, Xiaobo Wan, Shuang-Jiang Liu, and Shengying Li, Characterization of a unique pathway for 4-cresol catabolism initiated by phosphorylation in Corynebacterium glutamicum. Journal of Biological Chemistry, 2016. 291(12): p. 6583-6594.
2. Lei Du, Sheng Dong, Xingwang Zhang, Chengying Jiang, Jingfei Chen, Lishan Yao, Xiao Wang, Xiaobo Wan, Xi Liu, Xinquan Wang, Shaohua Huang, Qiu Cui, Yingang Feng, Shuang-Jiang Liu, and Shengying Li, Selective oxidation of aliphatic C-H bonds in alkylphenols by a chemomimetic biocatalytic system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017. Published ahead of print June 12, 2017, doi:10.1073/pnas.1702317114.
3. 李盛英, 杜磊, & 劉雙江 (2016) 一種酚類化合物氧化的生物催化系統(tǒng)及其應(yīng)用. Chinese patent. 201610015698.3.
