蛋白質(zhì)的糖基化是最重要的翻譯后修飾之一，同時基于蛋白質(zhì)糖基化的糖工程是對蛋白質(zhì)和酶進行性質(zhì)改造的重要工具。不同種類的糖基化修飾對蛋白性質(zhì)和功能的影響具有顯著差異，理解其背后的機制對于蛋白質(zhì)的糖工程改造具有重要意義。青島能源所與中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所合作，通過核磁共振結(jié)構(gòu)解析和分子動力學(xué)模擬闡明了為什么糖工程中常用的蛋白質(zhì)的硫-糖基化不能充分模仿天然的氧-糖基化，揭示了糖苷鍵類型在形成糖基化功能中的關(guān)鍵作用。該成果在線發(fā)表于生物化學(xué)領(lǐng)域期刊International Journal of Biological Macromolecules《國際生物大分子雜志》。
蛋白糖基化通過修飾糖基和蛋白間的相互作用，來改善蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性、溶解性和生物活性等方面的性能。最常見的天然蛋白糖基化方式是發(fā)生在天冬酰胺側(cè)鏈的氮-糖基化和發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸側(cè)鏈的氧-糖基化。而硫-糖基化則是糖基連接在蛋白半胱氨酸側(cè)鏈的硫原子上，由于硫和氧屬于同族元素，許多物理和化學(xué)性質(zhì)相近，并且硫-糖基化在制備過程中具有直接和簡便的優(yōu)點，S-C糖苷鍵比O-C糖苷鍵也更加穩(wěn)定。因此人們認(rèn)為硫糖基化可以很好的替代氧糖基化，并在一些研究和糖工程開發(fā)中得到了應(yīng)用。然而，另外也有一些研究表明，在糖苷鍵中從氧到硫的替代會導(dǎo)致糖基化的蛋白具有結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的顯著差異，其中的原因并不清楚。
青島能源所代謝物組學(xué)研究組與中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所譚忠平研究員課題組開展了長期的合作，以揭示糖基化對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的影響機制。在前期優(yōu)化了核磁共振結(jié)構(gòu)計算碳水化合物的參數(shù)，實現(xiàn)了解析糖基化修飾蛋白結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)流程（PLoS One, 2017, 12:e0189700）的基礎(chǔ)上，以里氏木霉的7家族纖維二糖水解酶Cel7A的碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）為模型，從結(jié)構(gòu)水平解釋了不同位置的氧-糖基化為什么會對CBM的性質(zhì)產(chǎn)生完全不同的影響，發(fā)現(xiàn)使蛋白性能提高的糖基化作用主要來自于糖基位點附近氨基酸間新的相互作用的引入和蛋白剛性的增加（Biochemistry, 2017, 56:2897-2906）。
為進一步探索不同糖基化對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)影響的機制，研究團隊以里氏木霉Cel7A的CBM為模型，系統(tǒng)的研究了CBM第三位氨基酸進行不同種類單糖基化和二糖基化修飾的蛋白質(zhì)（圖1）。通過核磁共振結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，由于S-C糖苷鍵相比O-C糖苷鍵具有更長的鍵長，導(dǎo)致硫-糖基化所連的糖基無法保持氧-糖基化時糖基與蛋白之間的相互作用，在結(jié)構(gòu)中硫-糖基呈現(xiàn)柔性松散的狀態(tài)，從而大幅削弱了糖基化對于提升蛋白穩(wěn)定性、增強底物結(jié)合的作用。分子動力學(xué)模擬的結(jié)果同樣顯示硫-糖基化所連的糖基比氧-糖基化的糖基具有更高的動態(tài)性，糖基和蛋白間的氫鍵強度變化是產(chǎn)生這種動態(tài)性差異的關(guān)鍵因素，該動態(tài)性改變了結(jié)合過程中的焓和熵，影響CBM與底物之間的結(jié)合。通過對二糖基化和單糖基化CBM的比較，確定了增加的第二個糖基對蛋白性能影響的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)機制。該研究揭示了氧-和硫-糖基化之間明顯的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)差異，這些差異能夠?qū)е绿腔?yīng)的顯著改變，并提示在糖基化改造過程需要謹(jǐn)慎對待糖基化類型的切換，對蛋白質(zhì)的糖工程研究具有重要的指導(dǎo)意義。
圖1 硫-糖基化與氧-糖基化所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)與動力學(xué)差異導(dǎo)致了兩種糖基化對蛋白質(zhì)性質(zhì)的不同影響。（A-C）硫-糖基化的CBM（CBMS3C-Man和CBMS3C-ManMan）與氧-糖基化的CBM（CBMS3-Man和CBMS3-ManMan）的結(jié)構(gòu)差異。硫-糖基化的結(jié)構(gòu)所連接的糖基呈現(xiàn)柔性松散狀態(tài)而氧-糖基化的結(jié)構(gòu)所連接的糖基呈現(xiàn)為收斂的固定結(jié)構(gòu)。（D-F）分子動力學(xué)模擬顯示結(jié)合纖維素底物后，硫-糖基化的CBM的糖基具有比O-糖基化的糖基更多的運動性和更少的氫鍵占有率，共同導(dǎo)致其結(jié)合底物能力變?nèi)酢?span>
青島能源所代謝物組學(xué)研究組陳超副研究員、中國醫(yī)學(xué)科院藥物研究所助理研究員馬博、青島能源所蛋白質(zhì)設(shè)計研究組王業(yè)飛副研究員為論文共同第一作者，青島能源所馮銀剛研究員、王業(yè)飛副研究員和中國醫(yī)科院藥物所譚忠平研究員為論文共同通訊作者。本研究得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金委、山東能源研究院、青島市自主創(chuàng)新重大專項、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程等項目的資助。(文/圖 陳超)。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.126649
Chao Chen#, Bo Ma#, Yefei Wang#, Qiu Cui, Lishan Yao, Yaohao Li, Baoquan Chen, Yingang Feng*, Zhongping Tan* (2023) Structural insight into why S-linked glycosylation cannot adequately mimic the role of natural O-glycosylation. Int. J. Biol. Macromol. 126649.
